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        1. 抗菌藥物敏感性試驗

          發布時間:2011年5月13日

              抗菌藥物敏感性試驗通常用于檢測被分離的各種病原菌對抗菌藥物的敏感或耐藥的程度,爲臨床正確合理地選用抗生素治療提供科學依據。准確的藥敏試驗對于臨床選擇適當的抗微生物藥物非常關鍵。衛生部建議目前我國抗生素藥敏試驗應當參照美國臨床實驗室標准化委員會(CLSI/NCCLS)文件進行。1999年我國衛生部制定了《紙片法抗菌藥物敏感試驗標准(SAST)》,並于2000年5月1日頒布實施。該標准是我們臨床微生物工作者必須遵循的基本法規。我國臨床微生物學家陳民鈞教授等自20世紀90年代初開始引進美國NCCLS藥敏試驗標准,並且每年根據新版及時做出更新要點報道,指導我國臨床微生物室藥敏試驗工作,使我國細菌藥敏試驗逐步走向標准化和規範化。

          常用的藥敏試驗方法有瓊脂擴散試驗(K.B法)和稀釋試驗定量測定最低抑菌濃度(MIC)。

              近年來,在抗菌藥物敏感性試驗方面,發展應用:分子生物學技術,檢測臨床分離菌株的耐藥基因,爲臨床藥敏試驗提供了更爲簡便、快速、准確、可靠的試驗方法。

          • 藥敏試劑和方法標准化

              准確的藥敏試驗首先要有標准的藥敏檢測試劑,包括藥敏紙片和培養基等,其次要求藥敏試驗方法的標准化。對此,我國SAST和美國NCCLS對藥敏紙片的各種抗生素含量和使用的培養基等都有嚴格的規定,要求臨床微生物實驗室必須遵循這些基本法則。標准要求藥敏試驗必須使用有國家食品藥品監督管理局(SFDA)或美國食品藥品管理局(FDA)批准的藥敏試劑。

          1、紙片瓊脂擴散法(K—B法)  選用M—H瓊脂培養基,適合快速生長的致病菌,對于苛養菌則需使用嗜血杆菌專用瓊脂平皿(HTMA/GCA)。K.B法簡便、經濟,但應注意不是所有細菌都適合用該方法檢測耐藥性。發酵菌K—B法藥敏試驗只適用銅綠假單胞菌和不動杆菌屬的判斷標准,其他非發酵菌,如嗜麥芽窄食單胞菌等建議用最低抑菌濃度(MIC)法檢測耐藥性,以避免誤導臨床錯用抗生素。此外,如果考慮爲多重耐藥致病菌,還需要進一步確定各種藥物的MIC,以保證臨床用藥的有效性。

          2、液體稀釋法  用于測定MIC、MBC(最小殺菌濃度)、MIC(能抑制50%試驗菌的MIC)和MIC(能抑制90%試驗菌的MIC)。液體稀釋法比較繁瑣,一般不作爲常規試驗。通常用于調查罕見耐藥,調查藥敏定性試驗結果敏感,但臨床療效不佳的原因,確定中介度的敏感性,有效地選擇二線藥,評價新藥。MIC藥敏測定必須關注的是在培養基制備和測定過程中藥物的失活,在不同培養基中,因爲成分和制備過程中藥物變化程度不同出現不同的MIC。

          3、濃度梯度法(E—test)  是一種新型的檢測細菌或真菌對抗菌藥物敏感性的方法,主要包括一個含有連續抗菌劑梯度的試條。該法與微量稀釋法具有良好的一致性,只是濃度梯度(E.test)法所測MIC值普遍略高于微量稀釋法,可能與E—test法所采用的連續抗菌劑梯度,以及橢圓抑菌環內有微小菌落存在,導致終點判讀誤差所致。E—test法藥敏試驗對于探討耐藥機制,准確鑒定耐藥性,指導臨床合理使用抗生素治療,對大量使用抗生素的醫院選藥監測和對新抗生素的評價具有重要意義。

          4、聯合藥敏試驗  對臨床上病原菌不明的感染、單一藥物不能控制的混合感染、全身性銅綠假單胞菌感染、長期用藥可能産生耐藥的感染(結核、慢性骨髓炎)和病原菌爲多重耐藥菌株等,宜作聯合藥敏試驗。

          5、藥敏試驗的藥物選擇  爲了使藥敏試驗結果符合臨床實際需要,在我國SAST和美國NCCLS標准中,根據臨床分離的病原菌類型,對藥敏試驗的藥物選擇做了具體規定,並按最新資料每年修正公布。藥敏試驗中藥物選擇原則應根據不同菌種選擇相應的抗菌藥做藥敏,而且抗菌藥物的選擇必須合理,並要經濟實用。

          6、實驗操作規範化  現代微生物實驗室的自動化、電腦化及微生物微量生化反應測試方法,可同時進行自動分析鑒定(ID)與藥敏(MIC)檢測,使細菌鑒定/藥敏分析逐步走向規範化、標准化、現代化。此外,值得注意的是,要獲得藥敏試驗的准確結果,還需遵守藥敏試驗的孵育溫度範圍:通常葡萄球菌屬爲33~35℃,不超過35℃,其原因是檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS),若孵育溫度超過35℃可能會漏檢。其他細菌的藥敏試驗孵育溫度在(35±2)℃。測MRSA的溫度以33~35℃最好,絕不能高于35℃。

          二、藥敏試驗質量控制和質量評價

          1.質量控制質控是耐藥性監測的基礎,WHO推薦的軟件WHONET.5可以對室內和室間質控進行評價。爲保障藥敏試驗的准確性,應當每日對監測數據進行評估,首先要按照標准做好室內質控,並參與室問質評(包括衛生部臨檢中心和省臨檢中心),將耐藥數據與各種感染的發病率、流行率、預後聯系起來,建立耐藥數據與各種抗生素使用情況之間的關系,根據耐藥數據,制訂幹預措施,控制抗生素的使用,並評價其效果。

          2.質控試驗頻率按M100-S14有關質控方面的修改意見,藥敏試驗用品來自新郵件或新批號要進行一天質控試驗;來自新廠家的MIC試驗用品要進行20~30天質控試驗。使用影響藥敏試驗的新軟件要進行5天質控試驗,而且要檢測本室所有正在使用的抗生素。添加任何新的未曾用過的抗生素,需要有20~30天滿意的質控試驗結果。接種用種子測濃度的方法改變時要進行質控試驗,從目測到光電比濁要質控5天。儀器修理好後質控一天。更換儀器硬件,如閱讀器、保溫箱,質控20~30天。這些試驗亦可與常規藥敏同時進行,質控結果合格,常規結果也合格。常規質控一般爲每日或每周進行質控試驗,以保證得到准確的結果。當質控結果可以接受時說明藥敏試驗所使用設備、試劑、培養基及耗材和試驗過程是符合要求的。

          三、藥敏試驗報告規則與藥敏折點判斷

          1.藥敏報告規則通常分敏感、耐藥、中度敏感3個檔次。中度敏感或中介度,這一範圍只是抑菌環直徑介于敏感和耐藥之間的緩沖域,以防止由于微小的技術因素失控所導致的較大的結果解釋錯誤,抑菌環落人中介度範圍,意義不明確,如果沒有其他可以替代的藥物,應重複或以稀釋法測定MIC。一般認爲藥敏結果與臨床約有80%~90%符合率,藥敏試驗是提供}台療感染性疾病最有力的依據,了解耐藥菌株的耐藥機制,利用藥敏譜可對被檢菌株進行鑒定。

          2.藥敏折點判斷據美國《NCCLS抗生素敏感試驗實施標准M100-S14手冊》中規定,超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)確證試驗陽性時,産ESBLs菌要報告含頭孢吡肟在內的所有青黴素類、頭孢菌素類及氨曲南耐藥。M100-S14手冊還強調當前仍然堅持3種細菌(大腸埃希菌、肺炎克雷伯杆菌、産酸克雷伯杆菌)適用于ESBL確證試驗規則,不能擴大到3種細菌之外。總之,細菌藥敏試驗標准化與規範化需要從多方面人手,從臨床標本采集,病原菌分離培養與鑒定,藥敏試劑合格、操作技術規範、質量控制嚴格,結果報告准確等各個方面加強。從事細菌學檢驗人員亦需不斷提高自身素質,協助臨床醫生理解耐藥性檢測結果的意義,指導臨床合理選用抗菌藥物,最大限度地發揮細菌室在抗感染治療中的作用。

          四、抗菌藥物敏感性試驗方法

          1.紙片擴散法(K—B法)藥敏試驗把含有抗菌藥物的圓紙片放在均勻地接種了實驗細菌的瓊脂平板上,抗生素的濃度梯度通過從圓紙片上擴散而形成。試驗細菌的生長在圓紙周圍一定距離處被抑制,抑菌圈的大小與細菌的敏感性有直接關系。回歸曲線表明MIC的對數與抑菌圈的直徑呈直線關系。

          2.稀釋法藥敏試驗分液體稀釋法和瓊脂稀釋法兩種,爲了定量測定抗菌藥物的活性,抗生素與肉湯或瓊脂培養基混合進行稀釋,然後種入被檢測細菌,孵育過夜,觀測結果:最低抑菌濃度MIC (minimalinhibitoryconcentration)是能夠抑制細菌生長的最低藥物濃度;最低殺菌濃度MBC (minimalbactericidalconcentration)是能夠殺滅細菌的最低藥物濃度;MIC如是能抑制50%試驗菌的MIC;MIC。。是能抑制90%試驗菌的MIC。

          ()紙片擴散法(KB)

          1.藥敏紙片根據我國SAST《紙片法抗菌藥物敏感試驗標准》和美國《CLSI/NCCLS>>標准要求,需采用經國內SFDA或美國FDA批准有生産文號的藥敏紙片。

          2.藥物選擇爲使常規藥敏試驗合理,應限制測定藥物的數量。根據SAST標准,腸道病原菌藥敏試驗首選藥物:A組作爲常規首選藥:包括氨苄西林(ampicillin)、頭孢唑啉(cefazolin)、頭孢噻吩(cefalotin)、慶大黴素(gentamycin);B組作爲臨床上重要藥物的首選藥:包括阿米卡星(amikacin)、阿莫西林一克拉維酸(ampicillin—clavulanate)或氨苄西林/舒巴坦(ampicillin/sulbactam)、哌拉西林/三唑巴坦(piperacillin/tazobactam)、替卡西林/克拉維酸(ticarcillin/clavulanate)、頭孢孟多(cefamandole)或頭孢呋辛(cefuroxime)、頭孢美唑(cefmetazole)、頭孢哌酮(cefoperazone)、頭孢西丁(cefoxitin)、頭孢噻肟(cefotaxime)或頭孢唑肟(ceftizoxime)或頭孢曲松(ceftfiaxone)、環丙沙星(ciprofloxacin)或左氧氟沙星(L—ofloxacin)、亞胺培南(imipenem)、哌拉西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillin)、甲氧苄啶/磺胺甲嗯唑(SMZ—TMP,sulfamethoxazole—trimethoprim)等,報告條件是只有當A組中同類藥物不敏感時才報告;C組爲替代或後備藥物,包括氨曲南(aztreonam)、頭孢他啶(ceflazidime)、氯黴素(chloramphenic01)、卡那黴素(kanamyein)、奈替米星(netilmicin)、四環素(tetracycline)、妥布黴素(tobramycin)等。適用情況包括治療某些地方性或流行性疾病,或對首選藥(特別是同類藥,如B-內酰胺類或氨基糖苷類藥物)多重耐藥菌株,治療對首選藥過敏的病人,治療不常見的菌種(如氯黴素治療沙門菌或某些假單胞菌)等方面應用。

          3.藥敏紙片保存在幹燥環境,8℃以下冷藏或-20℃冷凍保存。β內酰胺類藥敏紙片應密封冷凍保存,僅取出少量作爲日常使用,在冰箱保存約一周。有些不穩定的抗生素(如頭孢克拉、棒酸合劑)須冷凍保存,用時取出。紙片在使用前1~2小時從冰箱取出,暖至室溫再打開,以避免出現冷凝水。紙片啓封後應放人可密封的有幹燥劑的容器中,在有效期內使用,過期應廢棄。

          4.M—H瓊脂(Mueller—Hintonagar)培養基制備成分:酪蛋白水解物17.59瓊脂17.09牛肉浸膏2.09澱粉1.59H201000mlpH7.3±0.125℃制備:將上述成分加到1000ml雙蒸水中,混合,加熱煮沸,校正pH7.34-0.1,高壓滅菌15psi(121℃)15分鍾,取出後立即放40~50。C水浴。在無菌操作室內,水平台上傾倒平皿,瓊脂厚度4mm,內徑14cm平皿需培養基60~70ml,內徑9cm平皿需25~30ml。待平板冷至室溫,置2~8℃冰箱保存,須在1周內用完。注意:①每批制備的平板應抽樣放30~35℃24小時以上,檢查是否無菌,抽樣平板不可再用;②使用時,平板從冰箱取出,預熱至室溫,瓊脂表面應潮濕,但不應有水珠,培養時,平皿蓋上亦不應有水珠。

          5.接種菌液制備  ①增菌法:選擇瓊脂平板上形態相同的菌落至少4~5個,用接種環挑其頂部,移種到4~5ml肉湯或大豆酪蛋白消化液中,35℃培養2~6小時,菌液濃度達到或超過0.5單位麥氏比濁管濃度,用生理鹽水或肉湯校正菌液濃度至與麥氏單位標准比濁管相同[約(1~2)×108CFU/m1]。②細菌直接懸液法:可直接用過夜培養的菌落在鹽水或肉湯中制備接種菌液,濃度調至0.5麥氏單位標准比濁管。

          6.接種平板M.H瓊脂平板用前烘幹,用一無菌棉拭子蘸取菌液,並在試管上端管壁旋轉擠壓幾次,去掉過多菌液,用拭子塗布整個瓊脂平板表面,反複塗布幾次,每次將平皿旋轉60°,保證塗布均勻。接種後加蓋,晾幹幾分鍾後貼加藥敏紙片,注意校正菌液須在15分鍾內使用。

          7.貼紙片接種平板後,貼藥敏紙片,用鑷子或針尖壓一下紙片使其與培養基表面貼牢。紙片要貼均勻,紙片與紙片中心距離不得<24mm。原則上,直徑140mm平板貼12張紙片,直徑90mm平板貼6張紙片。貼上紙片15分鍾內,需把平板倒放,置在35℃孵箱中。

          8.培養在35℃孵箱經16~18小時培養後,觀測結果。注意:不能在CO:環境中培養,疊放平皿不要超過兩個。

          9.測量抑菌環孵育後,手持平皿,從背面目測檢查每塊平板,用卡尺測量每個抑制環直徑(包含紙片的直徑),並以mm爲單位記錄大小。

          10.結果判斷參照表6-3—1標准,根據抑菌環大小作出判斷,分敏感、中介和耐藥三級報告結果。

          11.質量控制所有敏感性試驗對于培養基,接種物、孵育溫度、時間等變動都很敏感。爲了進行准確、可靠的試驗,每次試驗均設大腸埃希菌(ATCC-25922)作爲質控菌株,質控符合要求,才能發報告。

          ()瓊脂稀釋法瓊脂稀釋法藥敏試驗

          是將抗菌藥物稀釋成不同濃度,然後與融化並冷至50~55℃的瓊脂培養基混合均勻,傾注平板,再接種試驗菌,經培養後,觀察細菌生長情況,能抑制細菌生長的最低藥物濃度爲該菌的最低抑菌濃度(MIC)。

          1. 抗菌藥物原液配制與稀釋阿莫西林、替卡西林、頭孢噻吩等大多數抗生素用0.1mmolfLpH6.0PBS(磷酸鹽緩沖液)溶解和稀釋;胺曲南用飽和碳酸氫鈉溶解後水稀釋;氟喹諾酮(環丙沙星除外)用1/2容量的水,滴加0.1mmoL/LNaOH至完全溶解水稀釋;阿奇黴素、氯黴素用95%乙醇溶解水稀釋,頭孢替坦用二甲亞砜溶解水稀釋。總之,要按標准要求溶解和稀釋各種抗生素。
          2. 培養基制備M.H瓊脂配制時加水量要減少1/10,以備添加稀釋好的抗生素溶液。瓊脂培養基經121℃滅菌15分鍾,于水浴中冷卻至45~50℃;在每個直徑9cm平皿中,加M—H培養基25ml,稀釋好抗生素溶液2.5ml,充分混合,制備含有抗生素的瓊脂平板,密封在塑料袋,4~8℃冰箱保存,可使用一周。
          3. 接種方法將試驗菌稀釋成107CFU/ml細菌濃度,取一環(約2μg)接種到含有一系列抗生素的瓊脂平板上。接種前平板必須相當幹燥,從低濃度瓊脂平板開始,在30分鍾內完成接種,每次試驗需點種一個不含抗生素M—H平板以及質控菌株(ATCC.25922)作質控對照。
          4. 培養接種好的平板,放置室溫讓接種液被充分吸幹後,置(35±2)℃孵箱內16~20小時,讀取結果。

          讀取結果和報告首先讀取質控菌株MIC,然後讀試驗菌株測定的MIC值,MIC單位爲¨/ml,根據MIC值,報告相應的敏感或耐藥結果,或同時將MIC值附在敏感或耐藥後面。

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